Гетман Войска Запорожского Иван Степанович Мазепа, пользуясь безграничным доверием Петра I, замыслил возможный переход на сторону Карла XII и образование из Малороссии «самостоятельного владения» под верховенством Польского короля.
В конце августа 1707 года последовал донос на Мазепу со стороны генерального судьи В. Л. Кочубея. Но донесение было признано ложным в свете хорошо известной личной вражды между Кочубеем и Мазепой: в 1704 году у Мазепы был роман с дочерью Кочубея — Матрёной, которой он был восприемником (крёстным отцом), что сделало брак невозможным, поскольку такая связь считалась инцестом. Царь, счёл этот донос ложным. По приказу Петра I Кочубей и также доносивший на Мазепу полтавский полковник И. И. Искра подверглись пыткам, после чего, 14 июля 1708 года, были обезглавлены.
Действие оперы происходит на Украине в начале XVIII века. Дочь Кочубея Мария покидает отцовский дом, готовая пожертвовать всем ради своей любви к Мазепе. Противоречивы чувства старого гетмана. Любовь к Марии принесла ему «блаженство и обновленье, и рай», вернула ему молодость. Но он не оставил своих честолюбивых планов, в угоду которым осуждает на казнь отца возлюбленной, своего друга — Кочубея…